Передімплантаційне генетичне тестування (PGT) є інструментом завдяки якому можливо мінімізувати ризики перенесення ембріона з хромосомними аномаліями до порожнини матки. Анеуплоїдія – це явище, коли загальна кількість хромосом у клітині відхиляється від набору 23 пари; 46 хромосом. Анеуплоїдія може проявлятися як додаткова хромосома або сегмент хромосоми (трисомія або часткова трисомія), відсутня хромосома або сегмент хромосоми (моносомія або часткова втрата) або комбінації обох варіантів. Більшість анеуплоїдій у ембріонів материнського походження, причому понад 90% помилок виникають під час оогенезу через порушення материнського мейозу I. Частота анеуплоїдії ембріонів експоненційно зростає у жінок старше 35 років. Однак, вік не відіграє такої значної ролі в чоловічому репродуктивному потенціалі, оскільки лише 1–8% сперматозоїдів є анеуплоїдними незалежно від віку. Через анеуплоїдії ембріонів імплантація гірша, підвищений рівень викиднів та вищий ризик народження плодів з хромосомними аномаліями. За час використання передімплантаційного генетичного тестування на анеуплоїдію (PGT-A) залишається багато проблем, таких як ризики, пов'язані з інвазивними діями, та труднощі в правильній інтерпретації мозаїцизму (в зразку присутні як клітини нормальні (еуплоїдні), так і аномальні (анеуплоїдні), що може призвести до помилок в аналізі хибнопозитивних та хибнонегативних результатів.
Для проведення передімплантаційного генетичного тестування виконується інвазивна біопсія трофектодерми на стадії бластоцисти, під час якої з ембріона вилучається 5-8 клітин. В останні роки відбуваються дослідження можливості проведення оцінки анеуплоїдності ембріонів без необхідності біопсії трофектодерми. Дані свідчать про те, що, розвиваючись «in vitro» ембріони вивільняють безклітинну (вільну) ДНК (cfDNA) у середовище для культивування, забезпечуючи альтернативне джерело генетичного матеріалу, доступ до якого можна отримати неінвазивним шляхом.
Неінвазивне передімплантаційне генетичне тестування (niPGT) – це метод, що пропонує менш інвазивну альтернативу традиційному PGT-A, який передбачає взяття біопсії ембріона. Цей метод потенційно безпечніший та менш інвазивний спосіб для тестування хромосомних аномалій. Неінвазивна PGT-A тісно пов'язана зі звичайною PGT-A, проте аналіз зразків та інтерпретація результатів дуже відрізняються. Аналіз результатів niPGT-A проводиться за допомогою власних алгоритмів, які враховують характеристики безклітинної (вільної) ДНК cfDNA. ДНК, виділена з культурального середовища, ампліфікується та аналізується за допомогою масового секвенування наступного покоління (NGS). Справжнє походження та механізми вивільнення ембріональної cfDNA у середовищі, де культивувалися ембріони досі не повністю зрозумілі.
На жаль, не існує специфічних методів виявлення мозаїцизму неінвазивним способом. До 80% людських бластоцист можна вважати мозаїчними. Дослідження показали, що бластоцисти, які мають статус мозаїка низького або середнього рівня (20–50% анеуплоїдних клітин) після звичайної оцінки PGT-A, мають подібний потенціал розвитку, як і ті, що є еуплоїдними. Однак, ембріони з високим рівнем мозаїцизму ближчі до анеуплоїдних бластоцист, і мають гірший потенціал розвитку.
Неінвазивне передімплантаційне генетичне тестування можна поділити на:
- niPGT-A (неінвазивне PGT для анеуплоїдії): виявляє хромосомні аномалії, такі як трисомії та моносомії, допомагаючи відбирати ембріони з правильним числом хромосом.
- niPGT-M (неінвазивний PGT для моногенних захворювань): скринінг на специфічні спадкові моногенні захворювання, такі як муковісцидоз або хвороба Тея-Сакса, без біопсії ембріона. Слід зазначити, що невелика кількість моногенних розладів була досліджена з використанням підходу cfDNA – niPGT-M. Однак, niPGT-M ускладнюється ризиком контамінації материнськими клітинами, причому деякі дослідження повідомляють про наявність ураженого батьківського генотипу в культуральному середовищі, тоді як при проведенні біопсії патологій не було виявлено.
- niPGT-SR (неінвазивний PGT для структурних перебудов): виявляє хромосомні структурні перебудови, такі як транслокації або інверсії.
Основними вимогами для коректного проведення niPGT є:
- ретельна денудація (очищення) ооцитів проводиться для видалення материнських клітин кумулюса;
- ембріони промивають та переносять в індивідуальну краплю для культивування на завершальні стадії розвитку перед збором середовища;
- ембріони культивують протягом тривалого періоду часу, для отримання більшої фракції вільної ДНК в зразку культурального середовища.
Для уникнення проблем на шляху отримання коректних результатів niPGT вкрай важливо мінімізувати забруднення ДНК культурального средовища, щоб забезпечити ампліфікацію та аналіз лише ембріональної cfDNA, так як вона знаходиться в дуже маленьких концентраціях. Забруднення може бути материнським — що виникає із залишкових клітин кумулюса після денудації ооцитів (тобто забруднення материнськими клітинами). Також існують ризики екзогенного забруднення, яке виникає із зовнішніх джерел. Тому ретельне маніпулювання ембріонами та дотримання протоколу є критично важливими для зниження ризику впливу материнської/екзогенної ДНК на результат niPGT, оскільки будь-який тип забруднення може призвести до хибнонегативного результату.
Неінвазивне передімплантаційне генетичне тестування може бути альтернативним методом для пацієнтів, чиї ембріони були вітріфіковані (кріоконсервовані) без проведення PGT та біопсії трофектодерми. Такий варіант також може допомогти і пацієнтам, які проводили PGT-A, де біопсія трофектодерми не дала результату. Вітріфіковані бластоцисти п’ятої-шостої доби розвитку розморожують, промивають у свіжому середовищі та культивують протягом додаткових 8–24 годин (8 годин для бластоцист шостої доби; 24 години для бластоцист п’ятої доби) перед тим, як культуральне середовище аспірують та аналізують на хромосомну анеуплоїдію. Забір середовища на шосту добу забезпечує найнадійніші результати. Продовження культивування ембріонів до 6-го дня може суттєво вплинути на інформативність. Слід зазначити, що середовища, в якому культивувалися ембріони, аспіроване на п’яту добу, яке змінювалось на третю добу, показало нижчу інформативність та підвищену присутність деградованої ДНК (із залишкових клітин кумулюса), що може впливати на результати. Інформативність матеріалу зібраного на п’яту добу складала 55,6%, проте інформативність шостої доби була 84,6%.
niPGT – це відносно нова технологія, і дослідження для повної оцінки її точності та надійності тривають. Пропонуюється використовувати дану методику як інструмент пріоритезації для відбору ембріонів, а не як пряму заміну PGT-A, тому niPGT-A може бути викорастаний, як додатковий інструмент дослідження.