У сучасній репродуктивній медицині дедалі більшої уваги набувають методи, що дозволяють досягти вагітності з мінімальним втручанням в організм жінки. Однією з таких технологій є дозрівання ооцитів in vitro (IVM) — метод, який дає змогу отримувати незрілі яйцеклітини. На відміну від традиційного екстракорпорального запліднення де дозрівання ооцитів відбувається в організмі жінки під впливом гормонів, IVM пропонує більш щадний підхід. Це особливо важливо для пацієнток із онкологічними захворюваннями, коли затримка лікування чи гормональне навантаження є небажаними. Це особливо актуально в екстрених ситуаціях, таких як ті, у кого діагностовано лімфому Ходжкіна або лейкемію. У цих випадках незрілі ооцити, отримані трансвагінально, можуть бути дозріли in vitro та згодом вітрифіковані як варіант збереження фертильності.
Дозрівання ооцитів регулюється мережею скоординованих біохімічних сигналів, включаючи ендокринні, аутокринні та паракринні фактори. Дозрівання ооцитів – це складний процес, що регулюється різними молекулярними механізмами, включаючи відновлення мейозу та взаємодію між ооцитами та навколишніми соматичними клітинами. Воно включає підготовку ооцита до запліднення шляхом ядерного та цитоплазматичного дозрівання. Цитоплазматичне дозрівання охоплює накопичення молекулярних компонентів та подвоєння чи перерозподілу ключових органел, конденсацію хроматину та організацію структурних елементів, необхідних для запліднення ооцита, раннього дроблення та ембріонального розвитку аж до активації ембріонального геному. Це включає синтез мРНК та білка, внутрішньоклітинне зберігання кальцію, сплеск реплікації та цитоплазматичний перерозподіл мітохондрій, динаміку цитоскелета, перерозподіл кортикальних гранул до мембрани ооцита (оолеми) для полегшення запобігання поліспермічному заплідненню та підготовки оолеми до екструзії першого полярного тільця. Цитоплазматичне дозрівання включає накопичення антиоксидантів, таких як глутатіон, які захищають ооцит від окислювального процесу під час дозрівання та запліднення.
Дозрівання ядра відноситься до розриву зародкового міхурця (гермінального візикула), поділу гомологічних хромосом, появі перивітеллінового простору та виділення першого полярного тільця. Цей процес регулюється головним чином зниженням рівня циклічного АМФ (цАМФ), який активує фактор, що сприяє дозріванню (MPF), ключовий комплекс циклінзалежноїкінази 1-цикліну B (CDK1-цикліну B), що керує прогресією клітинного циклу через мейоз.Тільки ооцити, ядро і цитоплазма яких дозрівають одночасно, можуть мати потенціал для розвитку ембріона.
У міру того, як в ооциті відбувається дозрівання ядра, розподіл мітохондрій значно змінюється. Цей розподіл є дуже структурованим, а не хаотичним. Згідно з даними, отриманими за допомогою конфокальної візуалізації в реальному часі, просвічуючого електронного мікроскопа та ультраструктурного аналізу в дозрілих ооцитах in vitro, починаючи зі стадії GV антрального фолікула і до 5 годин до розпаду зародкового міхурця (GVB), мітохондрії переважно накопичуються поблизу перинуклеарної області та займають близько 80% цитоплазми.мікроРНК також є важливими для дозрівання ооцитів. мікроРНК можуть впливати на дозрівання ооцитів, змінюючи експресію генів та функцію кумулюсних клітин.
Під час IVM ооцити піддаються впливу умов in vitro, які змінюють характер локалізації та функції мітохондрій. Мітохондрії мають здатність мігрувати до областей з високим споживанням енергії, що є вирішальним для правильного дозрівання ооцитів. Метаболічна взаємодія між ооцитами та навколишніми клітинами кумулюса є важливою для розвитку ооцитів та мейозу. Мітохондрії всіх клітин є основним джерелом АТФ, а клітини кумулюса відіграють центральну роль у підтримці адекватного рівня АТФ в ооциті, забезпечуючи метаболічну підтримку через комунікацію щілинних контактів. Периферична локалізація мітохондрій необхідна для двостороннього зв'язку з клітинами кумулюса. Однак, після дозрівання мітохондрії мігрують до центральної області, і вважається, що однорідна локалізація мітохондрій є ознакою цитоплазматичної зрілості, тоді як периферична локалізація частіше зустрічається для мейотично некомпетентних ооцитів. На відміну від ооцитів, дозрілих in vivo, було продемонстровано, що ооцити IVM мають тенденцію до більшої локалізації мітохондрій у периферичній області, ніж у внутрішній цитоплазмі. Більше того, було показано, що в ооцитах IVM може бути змінена не лише локалізація, але й функціональна структура мітохондрій з іншими органелами.
Профілі експресії генів клітин кумулюса та ооцитів показують, що гени, що беруть участь у критичних процесах, таких як клітинна сигналізація, метаболізм та формування позаклітинного матриксу, є незамінними для належного дозрівання ооцитів. У самих ооцитах материнська РНК та білки, що накопичуються під час фолікулогенезу, є критичними, але лише підмножина експресованих генів безпосередньо пов'язана з розвитком компетентності.
Неоптимальні умови дозрівання in vitro (IVM) можуть призвести до змін у морфології мітохондрій, а також до змін в експресії генів, що кодують білки, пов'язані з функцією мітохондрій. Дисфункціональні мітохондрії мають нижчу здатність протидіяти виробленню активних форм кисню (ROS), що призводить до оксидативного стресу. Окислювальний стрес може серйозно пошкодити функцію ооцитів, окислюючи РНК, ДНК та білки; пошкоджуючи цілісність клітинної мембрани; та скорочуючи теломери. Найімовірніше, неоптимальні умови invitro можуть призвести до мітохондріальної дисфункції, що зменшує розвиток ооцитів у стадії IVM. Умови in vitro можуть впливати на мітохондріальні патерни в дозріваючому ооциті, ступінь змін може залежати від конкретних умов культивування та стану самих комплексів кумулюс-ооцит.
Наразі широко визнані два основні типи клінічних лабораторних протоколів IVM: звичайний протокол IVM та двофазний протокол IVM. У двоступеневій системі культивування пацієнти отримують болюс ХГЛ за 36–38 годин до пункції фолікулів. Ооцити, отримані за цим протоколом, можуть мати ооцити стадії MII (приблизно 10–20%), ооцити, що відновлюють мейоз in vivo (стадія розпаду GV або MI), та ооцити стадії GV (вони залишаються незрілими та потребують культивування IVM).
Протокол двофазного культивування IVM (CAPA-IVM)базується на традиційному підході IVM, включаючи фазу культивування перед IVM, призначену для підтримки зупинки мейозу перед початком IVM. CAPA-IVM передбачає дозрівання ооцитів із малих фолікулів розміром 2–8 мм без ін’єкції ХГЛ перед вилученням ооцитів. Отримані ооцит-кумулюсні комплекси потім культивують безпосередньо in vitro протягом 24–48 годин, доки вони не досягнуть стадії MII. Pre-IVM спрямована на підтримку розвитку ооцита in vitro, імітуючи природний прогрес, який відбувався б in vivo. Ооцит- кумулюсні комплекси - відіграють центральну роль у підтримці цього процесу.Система CAPA-IVM, покращує дозрівання ооцитів шляхом підвищення регуляції генів клітин кумулюса, пов'язаних з трансляцією та деградацією мРНК. CAPA-IVM є перспективною для синхронізації ядерного та цитоплазматичного дозрівання. Метою CAPA-IVM є створення середовища, в якому ооцити навмисно утримуються в стані мейотичного арешту, зберігаючи при цьому безперервну комунікацію між ооцитом і кумулюсом, тим самим сприяючи подальшому розвитку цитоплазми in vitro.CAPA-IVM покращує компетентність ооцитів та розвиток бластоцист.
Попередні дослідження показали, що внутрішньоклітинні месенджери, такі як циклічний АМФ (цАМФ) у ооцитах, що розвиваються, разом з попередником натрійуретичного пептиду C (NPPC) та його рецептором NPR2 в навколишніх гранульозних клітинах, мають вирішальне значення для підтримки зупинки мейозу протягом тривалого процесу росту та дозрівання ооцитів. Нещодавно запропонований підхід для покращення результатів IVM полягає у включенні попередньої інкубації IVM з модуляторами циклічного аденозинмонофосфату (цАМФ) для культивування ооцита перед індукцією мейотичного дозрівання. Створення середовища, яке забезпечує правильний баланс поживних речовин, метаболітів та ліпідів, є життєво важливим для дозрівання ооцитів in vitro. Для сприяння ядерного та цитоплазматичного дозрівання під час IVM додають: амінокислоти, гормони, цитокіни, антиоксиданти, та енергетичні субстрати та інші фактори росту до культурального середовища. Деякі фактори росту, отримані з ооцитів, включаючи фактор диференціації росту 9 (GDF9), кістковий морфогенетичний білок 15 (BMP15) та епідермальний фактор росту (EGF), відіграють вирішальну роль у впливі на якість ооцитів та ембріонів під час IVM. BMP15 та GDF9 експресуються у фолікулах, що ростуть. Крім того, BMP15 та GDF9, які присутні у фолікулярній рідині, значно посилюють дозрівання ооцитів in vitro. Фолікулостимулюючий гормон зазвичай використовується в системах культивування IVM для посилення дозрівання та зменшення атрезії. Додавання ФСГ до середовища IVM вважається необхідним для підтримки як ядерного, так і цитоплазматичного дозрівання ооцитів людини.
Динамічні системи культивування на основі мікрофлюїдики є дуже перспективною стратегією IVM, оскільки вони дозволяють точно контролювати клітинне мікрооточення, точно імітуючи динамічні умови фолікула яєчника. Мікрофлюїдні пристрої забезпечують безперервний потік поживних речовин, видалення відходів та контрольовані концентрації гормонів, метаболітів і кисню, тим самим підтримуючи як метаболічну, так і розвивальну компетентність ооцитів.
В даний час дозрівання незрілих ооцитів людини in vitro може досягати 70%, але потенціал розвитку зрілих ооцитів, отриманих in vitro, все ще нижче, ніж у зрілих ооцитів, отриманих in vivo. Eмбріони, отримані в результаті циклів IVM, демонструють вищі показники ранньої зупинки розвитку, особливо на стадіях двох та чотирьох клітин. Припускають, що це пов'язано з неповним дозріванням цитоплазми. 40–60% ооцитів IVM зазвичай досягають запліднення та раннього дроблення отриманих зигот. Частота настання клінічної вагітності при використанні процедури IVM у пацієнток молодого віку досягає 35%.
Враховуючи поточний стан систем IVM, індивідуальний підхід в застосуванні даної методики є дуже важливим для оптимізації клінічних результатів. Для підбору саме вашої індивідуальної стратегії лікування ви можете звернутися за консультацією до досвідченного лікаря-репродуктолога клініки IPF.