Інтрацитоплазматична ін'єкція сперматозоїдів (ІСSІ) є поширеними методами в галузі допоміжних репродуктивних технологій. Повна невдача запліднення після використання ІСSІ трапляється у 1–5% випадків. Основною причиною повної невдачі запліднення є дефіцит активації ооцитів, незалежно від того, чи походять вони від сперматозоїдів чи ооцитів, що призводить до нездатності зрілих ооцитів пройти активацію та повне запліднення сперматозоїдом.
Активація ооцитів – це просторово-часовий, регульований процес, який спричиняється серією внутрішньоклітинних коливань Ca2+ від потрапляння сперматозоїдів в ооплазмупід час злиття сперматозоїдів та ооцитів. Завдяки активації ооцитів відновлюється мейозу II (MII), екструзія другого полярного тільця (2PB), а також екзоцитоз кортикальних гранул та перебудови цитоскелета. Цей процес запускається сперматозоїдною фосфоліпазою C дзета (PLC дзета), яка транспортується до ооцита при потраплянні сперматозоїдів в ооплазму. Ооцити зазнають серії таких тимчасових змін Ca2+, які визначаються як коливання. Коливання Ca2+ визнані необхідними для успішної активації ооцитів, запліднення та ембріогенезу. Стійкі коливання Ca2+ сприяють утворенню пронуклеусів шляхом зниження активності протеїнкінази. Нестача кальцію може призвести до невдалого запліднення та аномалій дроблення.
Клінічно повна невдача запліднення пояснюється невдачею активації ооцитів зі сторони сперматозоїда, більше, ніж будь-якою іншою потенційною причиною. Сперматозоїди, які постійно не запліднюють ооцити після ІСSІ, або не викликають коливань Ca2+, або роблять це аномально. Сперматозоїди з морфологічними відхиленнями, як правило, демонструють різну здатність до активації ооцитів, навіть в межах одного зразка.
Фосфоліпаза C дзета (PLCζ) фермент, який є одним із головних факторів, що запускають активацію яйцеклітини після запліднення. Дефекти фосфоліпази C дзета (PLCζ),також впливають на кількість, рухливість, морфологію сперматозоїдів та цілісність їх ДНК. Такі сперматозоїди можуть мати аномальні структури та рівні PLCζ у головці.
Хоча основним джерелом вивільнення Ca2+ під час запліднення є ендоплазматичний ретикулум (ЕР), для підтримки цих коливань Ca2+ необхідний позаклітинний приплив Ca2+. Дійсно, виснаження позаклітинного Ca2+ зменшує частоту або повністю припиняє коливання Ca2+. В основі регуляції запасів Ca2+ лежить механізм, який називається введенням Ca2+, керованим запасами (SOCE). SOCE — це механізм надходження іонів кальцію (Ca²⁺) у клітину після виснаження внутрішньоклітинних запасів кальцію, переважно в ендоплазматичному ретикулумі.
Допоміжна активація ооцитів спрямована на стимуляцію відновлення мейозу в ооцитах шляхом штучного підвищення внутрішньоклітинних рівнів Ca2+. Механічні, електричні, хімічні або комбінація цих стимулів представляють собою різні засоби допоміжної активації.
Електрична активація зазвичай включає пряме застосування струму напруги, що індукує міграцію заряджених білків ліпідного бішару та утворення пор у мембрані, що дозволяє позаклітинному припливу Ca2+ в оолему. Один електричний імпульс викликає тривале, швидке підвищення рівня Ca2+ в ооциті, яке поступово повертається до вихідного рівня, активуючи ооцити. Хоча такий метод успішно використовувався для активації ооцитів, однак така процедура може індукувати утворення активних формкисню (АФК).
Механічна активація ооцита включає модифіковані методи ІСSІ з використанням мікроін'єкційної голки ІСSІ, що спирається на проколювання оолеми для викликання припливу кальцію з позаклітинного середовища, після чого виконується ІСSІ. Популярний метод механічної активації ооцитів полягає у ручному руйнуванні плазматичної мембрани з подальшою енергійною цитоплазматичною аспірацією, що збільшує навантаження Ca2+ в ооцитах під час ін'єкції та призводить до вищих показників запліднення. Така методологія також може встановити тісний контакт ін'єктованої сперми з внутрішньоклітинними запасами Ca2+ в ооцитах, що забезпечує швидшу дифузію фізіологічного сигнального шляху. Менш інвазивні методи спираються на створення потоку ооплазми шляхом механічного руйнування запасів Ca2+. Іншим методом механічної активації ооцитів є пряма мікроін'єкція Ca2+ в ооцит.
Хімічна активація ооцитів використовує сполуки, що сприяють внутрішньоклітинним переходам Ca2+ в оолемі, опосередкованим позаклітинним припливом. Такі агенти зазвичай є ліпідорозчинними сполуками, здатними транспортувати Ca2+ через клітинну мембрану, збільшуючи проникність Ca2+ та позаклітинний приплив Ca2+. Крім того, деякі сполуки, такі як IP3, також діють на внутрішньоклітинні запаси Ca2+. У випадку хімічної активації існує значна різноманітність між використовуваними хімічними речовинами, їх концентрацією, часом та тривалістю впливу, а також кількістю разів застосування. На сьогоднішній день найпоширенішим хімічним засобом активації ооцитів є A23187 (також відомий як кальциміцин), карбоксильнийантибіотик, який зв'язує двовалентні катіони, такі як Ca2+ та Mg2+, і вільно транспортує їх через усі біологічні мембрани. Іонофор кальцію є найбільш універсально використовуваною та найефективнішою методикою, який активує ооцити не тільки шляхом посилення внутрішньоклітинного Ca2+, але й за допомогою того ж методу рекрутингу з культурального середовища поза ооцитом.
Комбінації механічної, електричної та/або хімічної активації представляють собою інноваційний спосіб спроби використати унікальні переваги кожного способу активації,а також в деяких випадках використання культуральногосередовища гранулоцитарно-макрофагальнимколонієстимулюючим фактором (GM-CSF), збільшуючи бластуляцію та кількість високоякісних ембріонів.
Кальцій відіграє важливу роль у мітозі клітин. У численних дослідженнях продемонстровано, що запліднення ооцитів, яке не вдалося після ІСSІ, згодом було активовано іонофором кальцію, і активовані ооцити розвивалися нормально. Допоміжна активація ооцита за допомогою іонофора кальцію може покращити народжуваність у пацієнтів, сперматозоїди яких були отримані після біопсії яєчка (TESE) або тяжкою тератозооспермією. Наразі існує безліч клінічних випадків, які демонструють, що ІСSІ в поєднанні з допоміжною активацією ооцитів значно збільшує рівень запліднення та подальших вагітностей.Дослідження показали, що коефіцієнт запліднення у пацієнтів з використанням іонофору кальцію та ICSI становив 63%, на противагу у пацієнтів із невдачами запліднення цей показник складав 39%. Відсоток ембріонів гарної якості при використанні іонофору складав 63% та 48% у пацієнтів без використання активації ооцитів.
Індивідуальний підхід до вибору методів допоміжної активації ооцитів може сприяти підвищенню результативності програм допоміжних репродуктивних технологій та збільшенню шансів на народження здорової дитини у складних клінічних випадках.