Нормальним заплідненням після інтрацитоплазматичної ін'єкції сперматозоїда (ICSI) визначається поява двох пронуклеусів (PN) в ооциті через 16–18 годин після запліднення, що супроводжується наявністю двох полярних тілець (РВ). Один з пронуклеусів один з яких походить з ооцита, а інший — зі сперматозоїда.
Під час інтрацитоплазматичної ін'єкції сперматозоїдів (ICSI) один сперматозоїд вводиться безпосередньо в цитоплазму зрілого ооцита за допомогою мікроінструментів. ICSI, найефективніша на сьогоднішній день технологія, яка все ще може зазнати невдачі, незважаючи на середній рівень запліднення 70–80%. Іноді трапляється так, що жоден ооцит не запліднився, або кількість запліднених ооцитів вкрай мала, таке трапляється в 1 до 5% циклів з використанням ICSI. Відсутність запліднення (0PN) можна діагностувати після відсутності пронуклеусів та наявністю всього одного полярного тільця.
Визначення основних генних мутацій дуже важливе не лише для розуміння механізмів, що лежать в основі невдалого запліднення на молекулярному рівні, але й для лікування та діагностики безплідних пар. Нещодавні дані, отримані за допомогою секвенування всього екзому (WES), виявили генні мутації, що спричиняють погане або невдале запліднення після проведення ICSI .
Секвенування всього екзому (WES) у пацієнтів з зупинкою дозрівання ооцитів, повною відсутністю запліднення та зупинкою розвитку ембріона (EDA), виявило численні жіночі гени, що беруть участь у процесі запліднення. Повну невдачу запліднення пов'язують з дефіцитом активації ооцитів, пов'язаним з мутаціями в гені PLCZ1 у чоловіків та генах TLE6, WEE2, NLRP5, CD20, TUBB8 та PATL2 у жінок. Білок WEE2 бере участь у дозріванні ооцитів. Він відіграє важливу роль як у зупинці розвитку ооцитів до статевого дозрівання, так і згодом під час запліднення, дозволяючи ооциту пройти клітинний цикл. Втрата білка WEE2 може проявлятися як виштовхування другого полярного тільця після ICSI, але зрештою зупиняється в мейозі II після невдалого запліднення та відсутності утворення зиготи, що вказує на відсутність розвитку 2PN.
Загальновизнано, що запліднення починається, коли сперматозоїдний фактор фосфоліпаза С дзета (PLCZ1) вивільняється в ооцит. Білок PLCZ1 відповідає за індукцію характерних кальцієвих коливань, які стимулюють мейотичну прогресію під час запліднення. Коли PLCZ1 потрапляє в цитоплазму ооцита, стимулюється вивільнення кальцію (Ca2+). Дослідження показали, що для правильної структури акросоми та розподілу білка PLCZ1 необхідні мутації у двох актиноподібних білках сперматозоїдів, актиноподібному 7A (ACTL7A) та актиноподібному 9 (ACTL9). Відкриття білка PLCZ1 як основного фактора активації ооцитів сперматозоїдів дозволило розробити діагностичні тести, засновані на оцінці аномальної присутності PLCZ1. Зокрема, генетичний скринінг PLCZ1 став доступним та корисним аналізом, який виявляє аномалії в послідовності PLCZ1 у 30–40% обстежених пацієнтів з повною відсутністю запліднення ооцитів.
ICSI в поєднанні з допоміжною активацією ооцитів, штучною індукцією кальцієвих коливань за допомогою кальцієвих іонофорів, стала корисним методом лікування пацієнтів, які стикнулись з низьким відсотком запліднених ооцитів. Метою лікування допоміжною активацією ооцитів після ІКСІ є індукція достатнього вивільнення Ca2+ в ооцитах пацієнта для досягнення нормального рівня запліднення та подальшого ембріонального розвитку. Дослідники виявили, що відсутність сигналізації Ca2+ може змінити передімплантаційний розвиток, якість бластоцисти та профіль експресії генів. Такої індукції штучних коливань Ca2+ можна досягти різними методами, але один з найпоширеніших та ефективніших, є застосування хімічних агентів. Серед доступних агентів найчастіше використовуються іонофори Ca2+ (іономіцин та кальцимицин). Було показано, що допоміжна активація ооцитів збільшує рівень успішності ICSI у пацієнтів з глобозооспермією. Слід зазначити, що допоміжна активація ооцитів є ефективною лише для пар, де присутній лише чоловічий фактор. У випадках, коли ооцити повністю не запліднились, але в парі присутній жіночій фактор, рекомендовано використовувати донацію ооцитів.
Ще однією причиною поганого запліднення може бути невдала деконденсація головки сперматозоїда, передчасна конденсація хроматину сперматозоїдів, дефекти веретена поділу ооцитів, відсутність рухомих сперматозоїдів та важкі форми тератозооспермії, такі як глобозооспермія. Крім того, невдача запліднення може бути пов'язана обмеженою доступністю зрілих або морфологічно нормальних ооцитів. Цитоплазматичне, а також ядерне дозрівання є вирішальними для ооцитів, щоб вони могли належним чином реагувати на сигнали коливань Ca2+ сперматозоїдів у момент запліднення.
Формування 3PN (триплоїдія) є результатом двох обставин: поєднання одного материнського та двох батьківських наборів або поєднання одного батьківського та двох материнських наборів. Вважається, що 3PN є результатом поліспермічного запліднення або мейотичної недостатності, спричиненої ооцитами. Поліспермія не виникає при проведенні ICSI, оскільки в кожен ооцит вводиться лише один сперматозоїд. Показано, що механізм формування 3PN після ICSI має переважно дигінне походження. Дигінна триплоїдія виникає внаслідок невдалого вигнання другого полярного тільця в мейозі II та подальшого запліднення диплоїдного ооцита. Така ситуація може виникнути при пошкодженні метафазної пластинки або цитоскелету ооцита після аномального формування веретена поділу або у вікових жінок.
Також дослідники відмічають, що утворення 3PN у випадках ICSI, в яких у чоловіка були серйозні аномалії сперматозоїдів; вони виявили, що 33% триплоїдів були зумовлені диплоїдними сперматозоїдами. Крім того, інші дослідження продемонстрували, що присутність диплоїдних сперматозоїдів підвищена в олігозооспермічних зразках, що свідчить про те, що ці сперматозоїди можуть сприяти розвитку триплоїдії.
Вважається, що зиготи 1PN виникають в результаті партеногенетичної активації батьківського або материнського матеріалу, або внаслідок аномального формування ядерної оболонки, такого як асинхронність появи пронуклеусів, затримка формування пронуклеусів або злиття чоловічих та жіночих пронуклеусів. Зиготи 1PN спостерігаються у 2,7–7,7% випадках. При виявленні 1PN для оцінки запліднення неможливо визначити, чи присутні лише материнські чи батьківські хромосоми, чи зигота є диплоїдною. Крім того, було виявлено, що зиготи 1PN мають низький потенціал розвитку. Фактично, швидкість розвитку бластоцист з зигот 1PN складає 6,6% проти 34,0% при 2PN. Це частково зумовлено тим, що значна їх частина є гаплоїдною, що призводить до зупинки розвитку.
Використання ембріонів 1PN залишається суперечливим через їх невизначений генетичний склад. Отже, такі ембріони 1PN можуть бути регулярно відкинуті, ігноруватися для використання, навіть якщо утворюється бластоциста, або бути позбавлені пріоритету для перенесення. Однак з'являються нові докази того, що живонароджені діти можуть виникати після перенесення бластоцисти 1PN, що вказує на те, що кількість PN не завжди може відповідати плоїдності ембріона. Крім того, дослідження з використанням преімплантаційного генетичного тестування (PGT) на анеуплоїдію (PGT-A) на стадії бластоцисти показали, що ембріони 1PN можуть бути еуплоїдними (хромосомно здоровими) диплоїдними та мати двобатьківське успадкування. Важливо зазначити, що не всі платформи PGT-A можуть тестувати всі три генетичні фактори. Наприклад, секвенування наступного покоління (NGS) обмежується лише тестуванням на еуплоїдію.
Якщо в циклі ЕКЗ повністю не запліднились ооцити або запліднення аномальне, не обов'язково що така ситуація станеться в наступному протоколі. Зміна стимуляції наступного разу може призвести до отримання більшої кількості зрілих яйцеклітин. Сперматозоїди також можуть бути кращими в наступному циклі. Слід зазначити, що секвенування всього екзому (WES) може стати гарним діагностичним інструментом та дозволити розробити більш точні та персоналізовані методи лікування.